实验原理
BCA(bicinchoninic 万邦达股吧002547股票 acid)是一种稳定的水溶性复合物,在碱性条件下,二价铜离
子可以被蛋白质还原成一价铜离子,一价铜离子可以和BCA相互作用,两分子
的BCA螯合一个铜离子,形成紫色的络合物,该复合物为水溶性,在562nm
处显示强吸光性,在长盛同德一定浓度范围内,吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系,
制作标准曲线,因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。
实验准备
1. BCA定量试剂盒:含A液和B液
A液:BCA碱性溶液(配方:1%BCA二钠盐,0.4%氢氧化钠,0.16%酒石酸
钠, 2%无水碳酸钠,0.95%碳酸氢钠,这些液体混合后再调PH至11.25) B
液:4%硫酸铜
2.牛蛋白血清(BSA)
3.待测的蛋白样品
实验步骤
1.配置BCA工作液:将A液和B液摇晃混匀,按照A:B=50:1的比例配置BCA
工作液,充分混匀。(BCA工作液室温下24h内稳定,故现用现配)
2.配置不同浓度的标准蛋白液(BSA),1ugul,2.5 ugul,5 ugul,7.5 ugul,
10 ugul,待测蛋白样品在什么溶液中,就用该溶液来稀释标准蛋白液(如待测
样品溶于强RIPA裂解液,则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液)。
3.取空白组(0ugul BSA)各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中,另取待测
的蛋白样品5ul,加入96孔板。
PS:上图加样的量仅作为参考,蛋白液和BCA工作液的比例符合即可。
4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液,混匀,37度放置30分钟,
(加样时应当动作轻柔,防止产生气泡影响读数)。PS:温度和放置时间可以
调整,可在60度放置30分钟or室温放置2小时。
5.静置结束后,冷却至室温,用酶标仪测定562nm出的吸光度000852股票 ,并制作标准曲
线。
6.根据待测样品的吸光浙江板块度,比对标准曲线,计算蛋白的浓度。
注意事项
BCA法测定蛋白浓度时,吸光麦哲伦基金度可随时间的延长不断加深,且显色反应会随温
度升高而加快,故如果浓度较低,适合较高温度孵育or延长孵育时间。
标准蛋白液的加量应当准确,如果加量不准确,会导致制作出来的标准曲线出
现偏差,影响待测样品的浓度计算,所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置
标准蛋白液,另一方面应使用精确度高的移液枪。
A液和B液混合可能出现浑浊,此时应成分振荡混匀,最后可见透明溶液。
为加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热,但切勿过热。
当结果出现空白组本身就有较高的背景,可用Bradford法重新测定蛋白浓度。
优缺点
优点:
测定快速简便,45分钟内完成
准确灵敏,检测浓度为5-200 mgml
干扰物质少,BCA法不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响,可兼容样品
中高达5%的SDS,5%Triton X-100,5%的Tween 20
在一定浓度范围内,有良好的线性关系
检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝法蛋白定量
缺点:
与荧|分红型基金光蛋白质定量等方法相比,属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够
蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果
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